Precauzioni per l'elettroforesi in gel di poliacrilamide

· poliacrilamideU gel deve esse ottenutu da u monomeru di acrilamide, u materiale di partenza di a polimerizazione, u catalizatore, è u dirittu di a mistura di sale è buffer inseme.

· acrilamideè BIS (N, N'- metilene doppia acrilamide) hè a matrice di gel in forma di monomeru.

· U persulfatu d'ammoniu principia u prucessu di polimerizazione di l'adesivu. A formulazione di a colla richiede una soluzione di persulfatu d'ammoniu à 10% preparata in acqua. A maiò parte di l'infurmazioni indicavanu a necessità di un usu attivu. Tuttavia, a soluzione à 10% pò esse piazzata à 4 ℃ per parechje settimane senza perdita significativa di attività. Aghjunghjite finu à 10 ml è scartate quandu a colla ùn riesce micca à aggregà.

Cunsigliu: A percentuale diacrilamideIn a sequenza, a colla è a colla di proteine ​​ùn sò micca listesse. Sè aduprate una suluzione di acrilamide: BIS prefabbricata, assicuratevi di ottene a buttiglia ghjusta.

· TEMED (N, N, N', N'- tetrametil etilendiamina) hè un catalizatore, in una buttiglia marrone, posta in u frigorifero. Aghjunghje ghjustu prima di versà a colla.

· U vetru utilizatu per l'elettroforesi di poliacrilamide deve esse lavatu prima è dopu ogni volta. Dopu l'elettroforesi, lavate cù una spazzola dolce è un pannu in acqua calda saponata, sciacquate cù acqua distillata è lasciate asciugà.

· L'umidità è a polvera ponu causà cuntrullazione cù u polimeru cavu. Prima di l'elettroforesi, pulite a piastra di vetru cù un detergente per vetru è asciugatela cù una spazzola dolce. Lavate cù acqua distillata è asciugate bè cù una salvietta di carta. U risciacquu cù etanolu à 70% prima di asciugà cù a carta aiuta à pulisce è accelerà l'asciugatura. Aghjunghjite campioni di acrilamide successivamente: BIS, acqua, soluzione tampone, persulfatu d'ammoniu, TEMED. Scuzzulate bè è versate subitu.

Ùn hè micca necessariu di degassà a poliacrilamide prima di a polimerizazione. (L'acrilamide era prima piazzata in un vacuum per caccià e bolle perchè l'ossigenu inibisce a polimerizazione.)

Punte di mostra di punti di colla orizzontali.

· mette un pezzu di carta nera in a scatula di fondu, cù un fondu neru per fà un pirtusu di mostra per vede più chjaramente.
· tampone pienu di colla, ghjustu sopra u colloide.
· s'ellu ci hè una luce nant'à u bordu, accendete e luci, lasciate chì a luce brilli in u colloide. Pigliate u campione in a pipetta.
· aduprendu un dispositivu di pipettaggio automaticu.
· in 10-200 mu 1 puntu di muvimentu di liquidu pò esse adupratu in a maiò parte di i punti nantu à u campione. Per i fori di campione assai chjuchi (menu di 10μ1), a testa di pipetta longa aduprata per a colla di sequenziamentu hè più pratica.

· pipettà appena immersi in u campione, inalà un fluidu chì si move pianu pianu. U campione pò sembrà appiccicaticciu cù a glicerina, è u pompaggio rapidu pò attirà bolle d'aria in a testa di a pipetta.

· I campioni dopu avè inalatu a testa di pipettazione, moveranu delicatamente a testa di u fluidu nantu à u bordu di u tubu o, asciugandu a carta, aspireranu a testa di u liquidu fora di e gocce. Attenti à ùn succhià u campione.

Pone u campione in u foru di mostra

· dispusitivu di pipettazione per mantene una piccula pressione, fà chì i campioni si movenu ligeramente a testa di liquidu di traboccu.
· a testa di pipetta inserita in u buffer, ligeramente più alta di i fori di u puntu, mantene una pressione pusitiva. A punta di a pipetta pò esse inserita in un picculu foru.
· pianu pianu è regularmente i campioni fora. A punta di a pipetta hè posta sopra u foru di mostra puntuale, è u campione affonderà in u foru. Lasciate chì u campione affondi per riempie u foru di mostra invece di spinghje in dentro.
· una volta l'ultima goccia di campione cù a testa liquida, u liquidu si moverà à a seconda gamba, alzate pianu pianu u muvimentu di u liquidu, esce da u buffer

Cumu fà un campionamentu di colla verticale?

· fori di campione à puntu di colla verticale furmati trà dui pezzi di vetru. In una colla assai fina, a testa di a pipetta ùn pò mancu esse inserita trà duie piastre di vetru. Attenti à a glicerina! Pone a testa di a pipetta sopra u foru di campione è u campione affonderà in u foru.
· puntu campione prima, assicuratevi di mette u puntu verticale di u foru di campione di gel acil di polipropilene hè sciacquatu pulitu. Lavate l'acrilamide micca polimerizzata è l'acqua chì pò cumparisce in fondu à u foru di campione. L'acqua pò fà u foru di campione significativamente più chjucu. Aduprate una siringa di 25 ml o 50 ml è un agulla di calibru 18. Versate u buffer di elettroforesi è sciacquate cù cura u foru di campione.
· pò esse difficiule di vede u foru di u campione, ma à u listessu tempu, u restu hè faciule. S'ellu ci sò fori in eccessu, u buffer di campione pò esse testatu cù u blu di bromofenolu.